Hinchazón total de la resina.
Pesar 2,0 g de resina Wang en blanco en un tubo de reacción limpio y seco, añadir 15 ml de DMF y activar a temperatura ambiente durante 30 minutos aproximadamente.
Toma el primer aminoácido.
A temperatura ambiente, filtrar el disolvente del paso anterior a través de un núcleo de arena y añadir 1 mmol, 5 exceso molar de C. Primer aminoácido al final, 5 veces el exceso molar de DMAP, 5 veces el exceso molar de DIC, DMF. Hacer la reacción a temperatura ambiente del disolvente durante 3 h. Úselo después de que se complete la reacción Lavado con DMF 4 ~ 6 veces, 5-6 veces cada vez ml. Luego agregue una cantidad adecuada de piridina y anhídrido acético con una proporción de volumen de 1:1 y reaccione durante 30 min. Úselo después de que se complete la reacción Lavado con DMF 4 ~ 6 veces, 5-6 veces cada vez ml. (efecto: bloquea los micropuntos activos en la resina vacía no reactiva).
Fmoc Salida de grupos protectores
Retirar el solvente del paso anterior mediante filtración por succión, y agregar 10 mL 20% de piperidina DMF. Se agrega la solución a la resina, N2 Agitar 10 min Finalmente, filtrar la solución y agregar 10 mL 20% de piperidina DMF solución, N2 Soplar y agitar 5 min Luego filtrar la solución y repetir esta operación dos veces. DMF Lavar 4 veces, lavar 2 veces con metanol, 5-6 veces cada vez mL.
Probando el efecto de eliminación de la ninhidrina.
Saque una pequeña cantidad de resina, lávela tres veces con metanol, agregue ninhidrina, KCN, una gota de solución de fenol, 105 grados –110 grados Calentamiento 5 min. El color azul oscuro es una reacción positiva, lo que indica que la eliminación se ha completado y se puede llevar a cabo el siguiente paso de la reacción. Si es incoloro, significa que el grupo protector no se ha eliminado por completo y es necesario repetir la operación de desprotección anterior.
Luego se elimina el segundo aminoácido y el grupo de protección Fmoc.
Pese 3 veces el exceso molar de C. El segundo aminoácido al final, un exceso molar de 3 veces HBTU y un exceso molar de 3 veces de HOBT. En el tubo de reacción, agregue la cantidad adecuada de DMF. Después de que la solución se disuelva completamente, agregue un exceso molar de 10 veces (puro) DIEA, reacción a temperatura ambiente durante 40 minutos, use DMF Lave 4 ~ 6 veces, 5-6 veces cada vez ml. Tome una pequeña cantidad de resina y use la prueba con reactivo de detección de ninhidrina y aparecerá incoloro, luego agregue 10 ml de piperidina al 20% de solución DMF para eliminar Fmoc. Haga esto dos veces durante 10 min, 5 min, después de usar DMF Lave 4 veces, lave 2 veces con metanol, 5-6 veces cada vez en ml. Saque una pequeña cantidad de resina y utilice el reactivo de detección de ninhidrina para detectarla. Si la detección es azul, puede continuar con el siguiente paso de la reacción.
Por analogía, repita los pasos 2.6 hasta que la síntesis sea N. Retire el último aminoácido al final de la base Fmoc Protect, luego escurra.
Desprendimiento de resina y separación y detección de productos puros.
Finalmente, use solución de corte de ácido trifluoroacético (95% TFA:2% TIS:2% EDT:1% H2O) Corte 2 h, filtre la solución de reacción con succión y obtenga una solución de ácido trifluoroacético del polipéptido. Secar el lisado con nitrógeno tanto como sea posible, precipitar con éter, centrifugar y luego lavar con éter durante 3 segundos. ~5 veces, se obtuvo un sólido blanco. Después de disolverlo en agua pura, HPLC desalinizar y purificar, congelar-secar y precipitar cristales, tomar una pequeña cantidad para analizar MS.